Bà tên thật là Dương Thị Lệ Thủy, về sau đổi thành Trần Thị Lệ Thủy, sinh ngày 20 tháng 5 năm 1948 trong một gia đình nông dân nghèo tại làng Đông Thành, huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long. Gia đình bà có 8 chị em, trong đó, bà là chị cả.

Do cuộc sống khó khăn, từ nhỏ, bà đã theo gia đình lên Sài Gòn để mưu sinh. Năm 10 tuổi, nghệ sĩ nghiệp dư là Tư Long làm ở ban văn nghệ xóm bên tình cờ nghe bà ca vọng cổ, đã mời bà tham gia và gửi theo học ca cổ với thầy Năm Truyền làm thợ hớt tóc ở Khánh Hội. Sau đó, Lệ Thủy được gửi sang học bài bản cải lương 3 Nam, 6 Bắc với nhạc sĩ Tám Đen. Lúc đó, các em của Lệ Thủy liên tục đau ốm, gia đình nợ nần tứ phía. Không tiếp tục đến trường được do không có khai sinh, Lệ Thủy đã phải làm việc sớm để phụ giúp gia đình và quyết định xin đi theo làm việc ở gánh Trâm Vàng (Biên Hòa, Đồng Nai) để đỡ gánh nặng cho ba má.

Với bài ca cổ Cô gái bán đèn hoa giấy, đầu tiên qua việc ngâm thơ hậu trường, đóng những vai kép con trên sân khấu. 13 tuổi, Lệ Thủy thế vai kép con trên đoàn Trâm Vàng. 14 tuổi, Lệ Thủy đóng các vai đào nhì. Một thời gian sau, Lệ Thủy rời Trâm Vàng để về Công ty Kim Chung của ông bầu Trần Viết Long, một đại bang có 7 đoàn hát. Tại sân khấu này, Lệ Thủy đã được soạn giả Ngọc Văn nhận làm con nuôi, ông viết nhiều kịch bản đưa Lệ Thủy vào đóng từ vai phụ cho đến vai chính [1].

Sau những bước đi đầu tiên tạo được ấn tượng, ông bầu Trần Viết Long lập đoàn Kim Chung 3. Lệ Thủy chuyển sang đây diễn chung với nghệ sĩ Thanh Hải trong vở "Bẽ bàng duyên mới" của soạn giả Ngọc Văn. Tên tuổi của Lệ Thủy bắt đầu nổi lên, trở thành cô đào chính sáng giá lúc vừa tròn 15 tuổi.

Sau đó, Lệ Thủy hát ở đoàn Kim Chung 5, tại đây Lệ Thủy đóng cặp với Minh Phụng tạo thành cặp đào – kép ăn ý, được báo chí thời đó phong tặng là cặp "Bão biển" vì mang lại doanh thu cao cho đoàn qua các vở Xin một lần yêu nhau, Đêm lạnh chùa hoang, Kiếp nào có yêu nhau,... [2]

Năm 1975, Lệ Thủy gắn bó với Đoàn văn công Thành phố Hồ Chí Minh qua các vở diễn Cây sầu riêng trổ bông, Tiếng sóng Rạch Gầm, Khi bình minh trở lại...

Tháng 2 năm 1984, Lệ Thủy được vinh dự tham gia Đoàn nghệ sĩ lưu diễn Tây Âu cùng với nghệ sĩ Bạch Tuyết, Diệp Lang, Ngọc Giàu, Minh Vương,... với các vở diễn Đời cô Lựu, Câu thơ yên ngựa,... Báo chí thời đó gọi là "đem chuông đi đánh xứ người" đầu tiên sau sự kiện 30 tháng 4 năm 1975. Sau chuyến đi, các nghệ sĩ trong đoàn đã hợp lại và thành lập Đoàn nghệ thuật 2-84. Vở Tô Ánh Nguyệt và Đời cô Lựu là hai vở tuồng khai trương cho đoàn 2-84. Ở sân khấu này, Lệ Thủy đã diễn vở tuồng Tô Ánh Nguyệt, Áo cưới trước cổng chùa, Trắng hoa mai, Kiếp chồng chung, Lôi vũ,...

Những năm đầu 1990, Lệ Thủy chủ yếu hoạt động ở lĩnh vực video cải lương. Một số vở cải lương từng gắn với tên tuổi nghệ sĩ Lệ Thủy khi hát ở đoàn Kim Chung 5 trước năm 1975 cũng được quay video như Đêm lạnh chùa hoang, Tây Thi, Máu nhuộm sân chùa, Kiếp nào có yêu nhau, Băng Tuyền nữ chúa,.... Sau thập niên 1990, nghệ sĩ Lệ Thủy đi lưu diễn thường xuyên ở các tỉnh miền Tây, các vùng sâu, đem tiếng hát của mình gần hơn với khán giả nông thôn.

Sân khấu cải lương ngày càng gặp nhiều khó khăn. Bà cùng Diệp Lang và Minh Vương thành lập chương trình Những dấu ấn không phai trực thuộc Nhà hát Cải lương Trần Hữu Trang quy tụ các nghệ sĩ tham gia biểu diễn các vở tuồng kinh điển ngày xưa. Các vở diễn của chương trình như Giấc mộng đêm xuân, Tình mẫu tử, Một ngày làm vua, Đêm giao thừa,... Năm 2008, chương trình được hoạt động với tên gọi là nhóm xã hội hóa "Sân khấu vàng" trực thuộc Nhà hát Trần Hữu Trang nhằm tập hợp các nghệ sĩ tham gia biểu diễn đồng thời doanh thu từ chương trình dành vào cho hoạt động xây tặng nhà tình thương. Đến nay, "Sân khấu vàng" do Lệ Thủy và Minh Vương thành lập đã dựng các vở diễn như Sông dài, Lá sầu riêng, Một ông hai bà, Đêm lạnh chùa hoang,... và đã trao tặng hơn 30 căn nhà tình thương cho các gia đình khó khăn.

Hiện tại, Lệ Thủy vẫn cộng tác thường xuyên với Nhà hát Cải lương Trần Hữu Trang trong các chương trình biểu diễn phục vụ công chúng và tham gia đi show ở các tỉnh thành.

Các nam nữ nghệ sĩ mà Lệ Thủy đã hát, diễn chung: Minh Vương, Minh Phụng, Út Bạch Lan, Thanh Tuấn, Bạch Tuyết, Phượng Liên, Thanh Sang, Bảo Quốc, Thanh Ngân, Phượng Hằng, Trọng Hữu, Minh Cảnh, Tấn Tài, Huyền Trang, Phi Nhung, Diệp Lang, Thanh Kim Huệ, Ngọc Giàu, Trọng Phúc, Mỹ Châu,...

Bà được đánh giá là cô đào sáng giá của sân khấu cải lương và không hề kén chọn người đóng chung, đóng với ai bà cũng rất hợp như: Minh Vương, Minh Phụng, Tấn Tài, Thanh Sang, Minh Cảnh,... đến những cô đào như: Bạch Tuyết, Ngọc Giàu, Phượng Liên, Mỹ Châu, Út Bạch Lan,...